經(jīng)過數(shù)百年的人工栽培，西紅柿已經(jīng)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，而且紅色是西紅柿最主要的外觀質(zhì)量指標(biāo)，并且紅色果實(shí)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用價(jià)值。

由于果色是由多個(gè)基因調(diào)控的，因此如何在番茄果色形成過程中進(jìn)行精細(xì)檢測(cè)與分級(jí)，是一個(gè)亟待解決的科學(xué)問題。

果肉色澤是由多個(gè)重要的遺傳因子共同決定的，其中一些重要的調(diào)控因子如：rs,nor,Gr,Cnr,Nr,hp,t,Del,Aft,atv,Abg等的變異導(dǎo)致了不同的色澤。

西紅柿果皮的色彩比較單一，而且很容易進(jìn)行分類，通常情況下可以將其分成兩種類型：彩色果皮和無色透明果皮。

彩色果皮對(duì)無色果皮具有顯性作用，由SIMYB12基因所控制，在果實(shí)的生長(zhǎng)過程中，由于SIMYB12基因不能表達(dá)，因此不能在果皮中積累類黃酮。

SIMYB12基因在蘋果中的過量表達(dá)可使其在蘋果中呈彩色，且具有較強(qiáng)的貯運(yùn)能力。

果實(shí)色澤的鑒別方法有目測(cè)和儀表兩種，直觀鑒別法是一種比較典型的、使用方便、基礎(chǔ)簡(jiǎn)單的測(cè)色方式，它只適合于那些比較簡(jiǎn)單的分類。

由于種皮顏色的變化幅度非常大，而且大部分都是連續(xù)的，因此直接鑒別法很難受到人類的干擾，很可能會(huì)忽視掉某些中間的過渡色，這對(duì)于準(zhǔn)確的測(cè)量、分類和定量的分析是不利的。

儀器測(cè)定法則是利用各種設(shè)備，把顏色轉(zhuǎn)化成精確的數(shù)值，讓顏色數(shù)值化、具體化和可視化，這種方式操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，還可以對(duì)顏色進(jìn)行更加準(zhǔn)確的測(cè)量和分類。

色差儀被用于多種農(nóng)作物的果皮或果實(shí)的色澤的測(cè)定，例如櫻桃番茄、黃瓜和辣椒等。

隨著人們生活質(zhì)量的提升，鮮紅、無色、透明、果皮、果肉的粉色西紅柿的需求量越來越大，但有關(guān)其色澤的功能性標(biāo)志及其精確檢測(cè)方法還鮮有報(bào)道。

祝光濤課題組前期工作中，首次發(fā)現(xiàn)粉果番茄SIMYB12編碼的啟動(dòng)子前4kbp區(qū)域有603bp長(zhǎng)片段，該片段將導(dǎo)致該區(qū)域的遺傳變異。

在此基礎(chǔ)上，以30個(gè)不同品種的番茄為材料，開發(fā)相應(yīng)的基因座，開發(fā)相應(yīng)的基因功能標(biāo)記。

利用激光光譜法測(cè)定果實(shí)色澤之間的關(guān)聯(lián)性，實(shí)現(xiàn)對(duì)果實(shí)色澤的快速、精準(zhǔn)識(shí)別，并探討果實(shí)色澤的判別臨界點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于SIMYB12單倍體形態(tài)調(diào)控果實(shí)色澤的研究較少，而基于SIMYB12單倍體形態(tài)構(gòu)建的遺傳多樣性及其在果實(shí)色澤形成中的作用機(jī)制尚無研究。

在此基礎(chǔ)上，以SIMYB12基因上與果實(shí)色澤相關(guān)的突變位點(diǎn)為切入點(diǎn)，通過構(gòu)建可重復(fù)使用的、可應(yīng)用于凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的、可檢測(cè)到果實(shí)色澤的多個(gè)遺傳變異的遺傳變異，從而建立果實(shí)色澤的精確、快速的鑒別方法，為果實(shí)色澤的遺傳改良及果實(shí)色澤的鑒別提供理論依據(jù)。

材料與方法

選擇泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所收集的30份番茄種質(zhì)資源為供試材料，包括櫻桃番茄28份和紅色大果番茄2份，命名從編號(hào)P1~P30。

參考Saghai-Maroof等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用CTAB法對(duì)番茄幼苗進(jìn)行了全基因組DNA的提取，用酶標(biāo)記法測(cè)定DNA的含量。

祝光濤對(duì)番茄果實(shí)色澤基因SIMYB12進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因位于第1對(duì)
SL2.40ch01:70935936-70938394bp區(qū)間，且該區(qū)間前4kbp區(qū)域有603bp序列丟失。

當(dāng)前，番茄參照基因組已經(jīng)升級(jí)至SL4.0，根據(jù)SIMYB12基因的最新注釋，從NCBI官網(wǎng)上下載了SIMYB12基因的最新拼接全基因組。

利用序列比較分析，找出SIMYB12基因與其丟失的10kbp的序列，在丟失的603bp的兩邊合適的地方，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使其具有適宜的尺寸。

通過Primer-Blast技術(shù)和NCBI技術(shù)比較，驗(yàn)證引物的專一性，并將其提交給生工上海公司，以驗(yàn)證其專一性。

PCR反應(yīng)系統(tǒng)（15微升）:1微升的模板DNA,1.5微升的10xbuffer,0.6微升的dNTP,0.6微升的前、后兩個(gè)引物0.6微升，0.3微升的TaqDNA聚合酶，10.4微升的ddH_2。

PCR方法：在94℃下進(jìn)行5分鐘的PCR處理，結(jié)果表明在94℃時(shí)，30秒時(shí)，在58.6℃時(shí)，30秒時(shí)，在72℃時(shí)，延長(zhǎng)時(shí)間90秒，共35次；在72℃下延長(zhǎng)10分鐘。

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，對(duì)各引物的PCR退火溫度進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)節(jié)，得出了最佳的PCR退火溫度。

瓊脂糖電泳法：以1.5%的瓊脂糖為基底，加入1%的gelred核酸染色劑，將DNA放大后的產(chǎn)品放入BerlowGelDoc膠體成像裝置中，對(duì)其進(jìn)行觀測(cè)和攝影。

對(duì)每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶進(jìn)行計(jì)數(shù)，其中較大的條帶用1表示，較小的條帶用3表示，雜合用2表示，而缺少的資料用0表示。

在一個(gè)完全成熟的西紅柿中，在一周內(nèi)以3個(gè)點(diǎn)為中心，用色差儀測(cè)量出L,a,b,C,h的值，然后求出它們的平均。

每種試材各取3株，每株試材3次，五種色差計(jì)的測(cè)定結(jié)果有各自的含義：L代表黑白通道，0表示黑色，100表示白色。a代表紅綠通道，a>0表示顏色偏紅，a<0表示顏色偏綠，b代表黃藍(lán)通道，b>0表示顏色偏黃，b<0表示顏色偏藍(lán)。

C是指色澤的飽和性或純凈性，較高的色度性表示色澤較亮，h是一種色彩角度，它是指三種基礎(chǔ)色和它們之間的一種過渡色，0度代表著純紅色，120度代表著純綠色，240度代表著純藍(lán)色。

結(jié)果與分析

利用酶標(biāo)儀，對(duì)提取的番茄種質(zhì)DNA展開了快速檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品濃度OD26m/OD280nm范圍在1.81~1.99，比值低于1.9的樣品有10份。

比值高于1.9的樣品有20份，平均值為1.92，供試的30份番茄種質(zhì)DNA提取質(zhì)量均滿足后續(xù)常規(guī)PCR擴(kuò)增要求。

從NCBI官網(wǎng)上獲取了番茄最近一期全基因組DNA片段，采用比較分析法，確定了其中603個(gè)堿基的缺失區(qū)域。

使用Oligo7來設(shè)計(jì)引物，在SIMYB12的上游丟失序列的區(qū)域中，使設(shè)計(jì)產(chǎn)物擴(kuò)增碎片的尺寸為200~2000bp，此標(biāo)記適用于在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

本文以SIMYB12為對(duì)象，通過對(duì)16對(duì)引物進(jìn)行分析，結(jié)果表明其中3對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果均不含丟失的序列，且在擴(kuò)增結(jié)果中存在著碎片尺寸上的差別，不能作為鑒別丟失位置的有效方法。

其中5對(duì)引物定位在丟失區(qū)域中，能夠以單一的顯性方式檢測(cè)到丟失的基因，這5對(duì)引物都是顯性的。

除了A-13的擴(kuò)增片段較大，檢測(cè)效果不佳外，其它的都可以很好的檢測(cè)到果肉的顏色，但是不能很好的分辨出無色的、透明的果肉和丟失的信息。

在這一區(qū)域GC的含量較少，使得PCR很難進(jìn)行PCR，且通常采用普通的反應(yīng)系統(tǒng)和熱處理?xiàng)l件。

以P1、P9、P53個(gè)材料為供試材料，在不同的退火溫度下，對(duì)4對(duì)共顯性標(biāo)記進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A-10的擴(kuò)增效果最好，最適合的退火溫度是58.6℃，最后將A-10選擇為SIMYB12基因的分子功能標(biāo)記。

在30個(gè)材料中，18個(gè)材料在克隆到287個(gè)bp左右的特異性片段后，經(jīng)分子生物學(xué)分析，這些材料的果皮呈透明狀。

其中3個(gè)種質(zhì)在890個(gè)bp左右的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明該種質(zhì)具有明顯的純合性，并對(duì)種質(zhì)進(jìn)行了分子分析，結(jié)果表明該種質(zhì)為彩色種質(zhì)。

另外9個(gè)材料中，分別出現(xiàn)了287個(gè)和890個(gè)bp的片段，表明該區(qū)域存在著一個(gè)雜合體，其性狀為花色性狀。

以30個(gè)不同品種為材料，采用色差計(jì)對(duì)其果色進(jìn)行了測(cè)定，得到了其果色的L,a,b,c,h等指標(biāo)。

在這兩個(gè)顏色空間中，通過對(duì)果皮顏色進(jìn)行分析，最后利用三維坐標(biāo)對(duì)Lab進(jìn)行分析，將b≥45的果分類為彩色果皮，b<45的果歸類為透明果皮。

Ch值使用二維坐標(biāo)分析，將顏色飽和度C>60的分類為彩色果皮，2種數(shù)據(jù)分析方法的歸類結(jié)果是相同的。

利用色差計(jì)，可以迅速地測(cè)定各種果實(shí)的色澤，而大多數(shù)果實(shí)的色澤則可以用Ch測(cè)定法進(jìn)行鑒別。

在被測(cè)試的物質(zhì)中，用肉眼鑒別方法得到18個(gè)無顏色的、12個(gè)有顏色的；通過分子功能標(biāo)記分析，獲得了18個(gè)無顏色、12個(gè)有顏色、3個(gè)顯性、9個(gè)雜合種。

根據(jù)測(cè)定的鎘含量，采用色差分析方法對(duì)20個(gè)無顏色的果實(shí)和10個(gè)有顏色的果實(shí)進(jìn)行了鑒別。

結(jié)果表明，該性狀的遺傳變異與肉眼觀察結(jié)果的性狀一致，其中28個(gè)性狀與Ch鑒別結(jié)果一致，2個(gè)性狀不一致，其中P7、P8性狀不一致。

P7、P8是一種由SIMYB12基因突變所致的紫紅色西紅柿，其果實(shí)為彩色，但因?yàn)楹写罅康幕ㄇ嘬眨怨麑?shí)呈紫黑色。

討論與結(jié)論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，SIMYB12的上游有603bp的突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)可能會(huì)對(duì)SIMYB12的功能產(chǎn)生重要影響，是開發(fā)InDel的優(yōu)良位點(diǎn)。

參考祝光濤所發(fā)明的InDel分子標(biāo)志，王仁漢等在32個(gè)常用的西紅柿試材上證實(shí)了2個(gè)不能擴(kuò)大，而在16個(gè)小西紅柿上證實(shí)了正確的結(jié)果，其正確率為62.5%。

我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行改造，并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，從而進(jìn)一步提升其檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度。

在前期工作中，我們構(gòu)建的A-10功能性標(biāo)簽在15μL普通反應(yīng)系統(tǒng)中仍存在著難以放大的問題，后來我們將dNTPs添加至0.6μL，并對(duì)其進(jìn)行了熱處理。

當(dāng)采用53℃時(shí)，該方法的準(zhǔn)確率可達(dá)66.7%，但因該方法中副帶數(shù)目過多而導(dǎo)致雜合類型的錯(cuò)誤，在此基礎(chǔ)上將A-10的識(shí)別率提升至100%，克服了基因缺失區(qū)難以放大的難題。

紫紅色西紅柿P7、P8受花色苷代謝通路關(guān)鍵酶調(diào)控，使其果皮中的花色苷大量累積，從而使其色澤變紫。

不同色澤的西紅柿，只有紫紅色的色素與色差計(jì)所收集到的色素有差異，其他色澤的色素和紫紅色色素都是相同的。

在本試驗(yàn)中，供試的2份紫色番茄材料的果皮屬于彩色果皮，但是色差儀的Lab或Ch測(cè)量值都屬于無色透明果皮的標(biāo)準(zhǔn)范圍。

由于項(xiàng)目組已搜集到的紫紅色西紅柿種質(zhì)均為單色，無法進(jìn)行該部分比較實(shí)驗(yàn)，所以紫西紅柿在色澤上的判別，只能依靠常規(guī)的視覺判別方法。

在常規(guī)情況下，通常采用視覺檢測(cè)方法來進(jìn)行簡(jiǎn)單的識(shí)別和歸類，然而果實(shí)的色澤變化幅度非常大，且大多呈現(xiàn)出連續(xù)的特征。

因此，直接鑒別方法很難受到人類的干擾，不適合對(duì)果實(shí)色澤進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定和分類，也很容易忽視某些中間的過渡階段。

在儀器測(cè)定方法中，所采用的色差儀具有自身的照明系統(tǒng)，它不會(huì)受到外部環(huán)境的影響，可以對(duì)兩種不同的色彩進(jìn)行精確的測(cè)量，并且具有操作方便、無損的優(yōu)點(diǎn)。

通過對(duì)目測(cè)法和色差儀鑒定法測(cè)量結(jié)果與基因型的相符度進(jìn)行對(duì)比，可以看出除了紫色西紅柿的基因型與儀表測(cè)量法不一致之外，其他的供試西紅柿材料中，目測(cè)法和儀表測(cè)量法測(cè)量結(jié)果與基因型的檢測(cè)結(jié)果都是一樣的。

這說明儀表測(cè)量法可以被應(yīng)用到對(duì)非紫色西紅柿的測(cè)定，并且可以更準(zhǔn)確地對(duì)不同果皮的顏色進(jìn)行判斷，并對(duì)它們進(jìn)行分類。

SIMYB12的變異位點(diǎn)較多，且各單體型對(duì)果色性狀的效應(yīng)也不一致，因此我們利用該603bp的變異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一個(gè)A-10的功能性分子標(biāo)記，雖然不能全面反映果實(shí)色性狀，但可以應(yīng)用于多數(shù)品種。

該項(xiàng)目的實(shí)施將為今后開展以果實(shí)色澤性狀為目標(biāo)的遺傳改良提供重要的理論依據(jù)。